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$\gamma $ 辐照处理采用BIOBEAM GM2000型$\gamma $ 射线辐照仪(Biobeam GM2000, Leipzig,德国),放射源是137Cs密封源,剂量率2.5 Gy/min。碳离子辐照(80 MeV/u,剂量率20~50 Gy/min,LET为30 keV/µm)依托中国科学院近代物理研究所重离子加速器平台(HIRFL)进行。 -
实验所用的LacI基因缺失型大肠杆菌(LacI-)以野生型大肠杆菌MG1655(中国科学院天津工业生物技术研究所惠赠)为背景,利用CRISPR-cas9技术敲除基因组LacI基因构建而成。克隆载体PEASY-Blunt Cloning Kit购于北京全式金生物技术股份有限公司。LacI-大肠杆菌感受态细胞制备参照Inoue“超级感受态”细胞制备的方法[15]:LacI-感受态细胞菌株在LB固体培养基Z字形划线,置于37 ºC恒温培养箱培养12 h,挑取单克隆到SOB液体培养基中,18 ºC,180 r/min恒温摇床培养16 h,测出大肠杆菌OD600为0.4~0.6,使用低温冷冻离心机4 ºC 2 500 g离心10 min,弃上清。加入适当比例的Inoue转化缓冲液,4 ºC 2 500 g离心10 min,加入适当比例的Inoue缓冲液以及DMSO,混匀并进行分装,制备好的大肠杆菌感受态细胞于−80 ºC保存。
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使用融合聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)技术,设计具有互补末端的引物(表1),形成具有重叠链的PCR产物,再通过PCR产物重叠链部分的延伸,在不需要内切酶消化以及连接酶处理的条件下实现不同来源的DNA片段在体外的连接。首先构建含有同源序列的TetA基因片段,随后将构建成功的含有同源片段的TetA基因与LacI基因片段进行连接。连接成功的片段经PCR验证,并经过测序证明序列无误后进行下步实验。
表 1 融合PCR引物列表
引物名称 引物序列 TetA-2F GCTTGACACTTTATCACTGATAAAC TetA-R TCAGCGATCGGCTCGTTG LacI-F ACACCATCGAATGGCGCAAAACC LacI-R TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGG LacIF-TetR-R GGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTTCAGCGATCGGCTCGTTG TetR-LacIF-F CAACGAGCCGATCGCTGAACACCATCGAATGGCGCAAAACC -
取连接好的TetA-LacI基因片段5 µL与克隆载体PEASY-Blunt Cloning Kit 1µL在25 ºC的温度下进行平末端连接,将含有连接产物的质粒转化进入LacI- 大肠杆菌感受态细胞,5 µL的质粒转化LacI- 100 µL的感受态细胞,冰浴30 min,随后42 ºC热激2 min,热激过后继续冰浴2 min,加入900 µL的液体LB培养基将菌液补足至1 mL,37 ºC,200 r/min,培养1 h。PEASY-Blunt Cloning Kit克隆载体自身带有卡那霉素抗性,将培养好的菌液涂至含有卡那霉素抗性的LB固体培养基中,37 ºC培养12 h,含有TetA-LacI基因片段的质粒的转化子PEASY-Blunt-Tet-LacI可以通过卡那霉素抗性筛选获得。为了排除筛选到的单克隆为假阳性的情况,使用克隆载体PEASY-Blunt Cloning Kit的通用引物 M13F&M13R,将在卡那霉素抗性板上筛选得到的单克隆菌落作为模板DNA 进行 PCR 扩增并验证产物长度。
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小剂量质粒抽提试剂盒购于上海生工生物股份有限公司。
将含有TetA-LacI基因片段的质粒的转化子PEASY-Blunt-Tet-LacI单克隆挑至10 mL含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中,37 ºC,200 r/min培养,酶标仪检测到菌液OD600为0.5左右时,将菌液进行分装,分别进行
$\gamma $ 100 Gy、重离子100 Gy 的辐照。由于质粒在细胞中是高拷贝,难以同时分析发生在同一个质粒上的TetA基因重组和LacI基因突变,所以辐照处理后需将质粒提取并再次进行转化,确保重组和突变的质粒能够被特异性筛选。 -
不同剂量辐照后的菌液进行提质粒并重转化后,将含有转化子PEASY-Blunt-Tet-LacI的菌均匀地涂在添加四环素和卡那霉素抗性(统计四环素重组细胞)以及单独含有卡那霉素抗性的固体LB培养基(统计总的细胞数)上。未发生同源重组修复的质粒,四环素抗性基因没有活性,不能被四环素抗性板筛选。37 ºC培养16 h后,对培养板上的单克隆进行统计。四环素重组率(10n-m)=TetA基因重组细胞数(10n)/总细胞数(10m)。
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提取不同剂量辐照后菌的质粒并重转化后,将含有转化子PEASY-Blunt-Tet-LacI的菌均匀地涂在含有卡那霉素抗性的P-Gal培养板(统计LacI基因突变的细胞)和单独含有卡那霉素的固体LB培养板(统计总的细胞数)上。37 ºC培养72 h后,LacI基因发生突变,LacZ产生半乳糖苷酶并分解苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(P-Gal)产生半乳糖以供大肠杆菌利用,长出正常菌落,而LacI未发生突变的大肠杆菌由于半乳糖苷酶的表达量极少,72 h内不会产生可见菌落。因此用P-Gal作为唯一糖源的基础培养板可以用来筛选LacI突变子。将P-Gal+Kan抗性板上筛选得到的的单克隆重新挑菌至含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中,待菌液浑浊后,将菌液点涂至含有X-Gal的Kan+LB培养基上,进行蓝白斑筛选复筛,LacI基因突变可以使LacZ基因正常产生β-半乳糖苷酶,从而将无色化合物X-Gal切割成半乳糖以及深蓝色的5-溴-4-靛蓝。对培养板上的蓝色单克隆菌落进行统计,并测序验证。LacI突变率(10n-m)= LacI基因突变细胞数(10n)/总细胞数(10m)。
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100 Gy
$\gamma $ 和碳离子辐射处理后,提取菌液质粒并再次转化后,将含有转化子PEASY-Blunt-Tet-LacI的菌液均匀地涂在含有卡那霉素抗性的P-Gal培养板上,并统计LacI基因突变的细胞数(P-Gal培养板为营养缺失型培养板,无法同时加入卡那霉素与四环素两种抗生素),同时接种含有卡那霉素的固体LB培养板统计总的细胞数。37 ºC培养72 h后,将P-Gal+Kan抗性板上筛选得到的单克隆重新挑菌至含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中,待菌液浑浊后,将其接种在含有X-Gal的LB+Kan+Tet固体培养基中,如果菌落在含有Kan+Tet双抗性的LB培养基中可以正常生长,并且菌落呈现蓝色,表明筛选到了TetA基因发生同源重组及LacI基因产生突变的双突变克隆,并进行Sanger测序验证,筛选得到阳性双突变克隆,突变频率计算公式为:(Tet基因重组+LacI突变率)(10n-m)=(TetA+LacI突变细胞数)(10n)/总细胞数(10m)。 -
每个辐照实验重复3次,每次试验设置3个平行组,试验结果统计后算得平均值。实验数据的组间差异分析均采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义,P < 0.01为统计具有显著性差异。统计和绘图均使用Graphpad 8软件完成。
Construction and Validation of Experimental System for Heavy ion Radiation Targeted Loci Localization and lacI Mutation Analysis Based on Escherichia Coli
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摘要: 重离子辐射具有独特的物理和生物学特性,在诱变育种等领域有着广泛的应用,但其诱变的机制并不完全清楚。不同于传统的 X 和
$ \gamma $ 射线,重离子辐射具有较高的线传能密度(Linear energy transfer, LET),主要诱导团簇状的DNA损伤,其演化为遗传变异的过程更为复杂,突变类型也更难预测。目前的实验技术很难在序列水平对重离子击中DNA的靶点进行定位,这致使重离子辐射诱变机制的研究相对滞后。针对这一问题,根据重离子辐射诱导的团簇损伤核心区域富含DNA双链断裂(Double-strand break, DSB)以及同源重组机制对DSB特异性响应的特性,首先构建了四环素抗性基因(TetA)同源重组元件用于确定DNA团簇损伤的序列定位,并在重组原件侧翼连接反向突变筛选基因LacI用于团簇损伤—突变的检测,最后把该质粒转化到大肠杆菌E.coli。在此基础上,比较分析$ \gamma $ 射线与碳重离子(80 MeV/u)辐照后同源重组和报告基因突变的情况,验证了该体系用于重离子辐射靶点序列定位及突变检测的可行性,为进一步研究重离子辐射诱变的相关机制奠定了方法学基础。-
关键词:
- 重离子 /
- $ \gamma $射线 /
- 同源重组 /
- 团簇损伤
Abstract: Heavy ion irradiation has unique physical and biological characteristics and has been widely applied in crop and bacteria mutation breeding. However, the mechanism underlying heavy ion irradiation mutagenesis is not completely clear. Unlike the conventional X and$ \gamma $ ray, heavy ion irradiation has a high linear energy transfer(LET) and mainly induces clustered DNA damage, the evolution of which to genetic variation is more complex and mutation types are more difficult to predict. Due to the limitation of experimental techniques, it is difficult to localize the DNA target of heavy ions at the level of DNA sequence. To address this issue, we first constructed a homologous recombination(HR) element of tetracycline resistance gene (TetA) in light of high abundance of DNA double strand breaks(DSB) in the core of heavy ion radiation-induced cluster damage. And the DSB specific response of HR. We then linked a reverse mutation screening gene lacI to the TetA recombination elements to detect cluster damage-derived mutations. Finally, this plasmid was transformed into E.coli. Based on this experimental system we comparatively analyzed TetA recombinations and mutations of LacI gene after irradiation with$ \gamma $ -ray and carbon heavy ions (80 MeV/u). We preliminarily verified the feasibility of this research strategy and provided a methodological foundation for further investigation of the mechanisms underlying heavy ion radiation mutagenesis.-
Key words:
- heavy ions /
- $ \gamma $-ray /
- homologous recombination /
- clustered damage
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表 1 融合PCR引物列表
引物名称 引物序列 TetA-2F GCTTGACACTTTATCACTGATAAAC TetA-R TCAGCGATCGGCTCGTTG LacI-F ACACCATCGAATGGCGCAAAACC LacI-R TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGG LacIF-TetR-R GGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTTCAGCGATCGGCTCGTTG TetR-LacIF-F CAACGAGCCGATCGCTGAACACCATCGAATGGCGCAAAACC -
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